(財)千里ライフサイエンス振興財団　平成24年2月24日開催セミナー

平成24年2月24日（金）

腫瘍血管新生制御の分子基盤佐藤靖史　（さとう　やすふみ）東北大学加齢医学研究所腫瘍循環研究分野　教授
血管新生とは新しい血管ネットワークが形成される現象であり、血管系が持っている基本的機能の一つである。血管新生は厳密に制御されている現象で、生理的血管新生は胎児・胎盤形成や月経周期に一致した子宮内膜形成など限られた部位でしか生じないが、さまざまな病態でも観察され、それらの進展と関連している。特に癌において、腫瘍血管新生が癌の増殖・転移と深く関わっていることから、その効果的な制御法の確立が求められている。　血管新生は、促進因子と抑制因子の局所バランスによって調節されている。促進因子としては、特に血管内皮細胞に選択的に作用するVEGF（血管内皮増殖因子）の重要性が明らかとなっている。一方、抑制因子としてこれまでに報告されているのは、新生血管の侵入を阻害するバリヤーとしてのものが主体であり、生体に普遍的に備わっているフィードバック調節を担う因子は、こと血管新生の調節に関しては、これまで知られていなかった。　我々は、VEGFなどの血管新生刺激に反応して血管内皮細胞において発現変動される遺伝子群の網羅的解析を行い、２倍以上に誘導される機能未知の遺伝子の中から、血管内皮細胞が産生し、自らに作用して血管新生を抑制するネガティブフィードバック調節因子vasohibin-1(VASH1)を発見、さらに、そのホモログであるvasohibin-2(VASH2)の存在を明らかにし、これらvasohibinファミリー分子の血管新生における意義について独自の研究を展開している。　これまでの研究から、VASH1は主に血管新生部位の血管内皮細胞に発現して、血管新生の終息と新生血管の安定化に機能するのに対し、VASH2は、新生血管の周辺の間質に浸潤する単核球などに発現して、VASH1とは拮抗的に血管新生を促進することを明らかにしている。シンポジウムでは、これらvasohibinファミリー分子の腫瘍における役割に関する研究と、治療応用を目指した橋渡し研究を紹介する。

参考文献

・	Watanabe K, et al. Vasohibin as an endothelium-derived negative feedback regulator of angiogenesis. J. Clin. Invest. 114: 898-907, 2004.
・	Shibuya T, et al. Isolation and characterization of vasohibin-2 as a homologue of VEGF-inducible endothelium-derived angiogenesis inhibitor vasohibin. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26: 1051-1057, 2006.
・	Kimura H, et al. Distinctive localization and opposed roles of vasohibin-1 and vasohibin-2 in the regulation of angiogenesis. Blood 113:4810-4818, 2009.
・	Hosaka T, et al. Vasohibin-1 expressed in endothelium of tumor vessels regulates angiogenesis. Am. J. Pathol. 175:430-439, 2009.
・	Heishi T, et al. Endogenous angiogenesis inhibitor vasohibin1 exhibits a broad-spectrum anti-lymphangiogenic activity and suppresses lymph node metastasis. Am. J. Pathol. 176: 1950-1958, 2010.

腫瘍血管内皮細胞の薬剤抵抗性樋田京子　（ひだ　きょうこ）北海道大学大学院歯学研究科口腔病態学講座　特任准教授
がん組織を養う血管を標的とする血管新生阻害療法は全てのがんに共通する血管新生を標的としているため, 多くの癌腫で抗癌剤との併用で上乗せ効果が認められている.従来，血管内皮細胞を標的とする血管新生阻害療法には薬剤抵抗性が生じないと信じられてきたが, 最近, これらに対しても薬剤抵抗性が生じることが報告されている. そのメカニズムとして現在「腫瘍細胞による形質変化」が機序として考えられている．しかし,われわれは腫瘍内の血管内皮細胞そのものが薬剤抵抗性を獲得する可能性もあるのではないかと考えている．　これまでわれわれは腫瘍血管内皮細胞がgrowth factorや薬剤への感受性や遺伝子発現，増殖能，遊走能などが正常血管内皮とは異なることを報告してきた. さらに，腫瘍血管内皮細胞には染色体異常が認められた．また，腫瘍血管内皮細胞が正常血管内皮細胞に比較してMultidrug resistance gene-1 (MDR1) / p-glycoprotein (p-gp)の発現が高く，抗がん剤 paclitaxelに対して抵抗性があることを見出した．これらの腫瘍血管内皮細胞の異常性はがん細胞の培養上清処理によって引き起こされることもわかった．　さらに最近，転移能が異なる腫瘍由来の血管内皮細胞間において染色体異常の程度や薬剤感受性が異なることを見出し, 腫瘍の性質が異なると, 血管内皮の性質も異なることを示した. 　腫瘍血管内皮のheterogeneity，異常性の解析は，あらたな血管新生阻害剤の開発や治療時期･薬剤の選択･治療効果の判定を可能とするバイオマーカーの開発のためにも重要である．
(参考文献)　＊corresponding author

1.	Ohga N., Ishikawa S., Maishi N., Akiyama K., Hida Y.,　Kawamoto T., Sadamoto Y., Osawa T.,Yamamoto K., Kondoh M., Ohmura H., Shinohara N., Nonomura K., Shindoh M., Hida K.*：Heterogeneity of Tumor Endothelial Cells: Comparison between Tumor Endothelial Cells Isolated from Highly Metastatic and Low Metastatic Tumors, Am J Pathol, in press, 2011
2.	Akiyama K., Ohga N., Hida Y., Kawamoto T., Sadamoto Y., Ishikawa S., Maishi N., Akino T., Kondoh M., Matsuda A., Inoue N., Shindoh M. and Hida K* .: Tumor endothelial cells acquire drug resistance by MDR1 upregulation via VEGF signaling in tumor microenvironment, Am J Pathol, in press, 2011
3.	Akino T., Hida K*., Hida Y., Tsuchiya K., Freedman D., Muraki C., Ohga N., Matsuda K.,　Harabayashi T., Shinohara N., Nonomura K., Klagsbrun M. and Shindoh M.: Cytogenetic　Abnormalities of Tumor-Associated Endothelial Cells in Human Malignant Tumor. Am J Pathol, 175(6), 2657-2667, 2009
4.	Hida K., Hida Y., Amin D., Flint A., Panigrahy D., Morton C. and Klagsbrun M＊.: Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Res, 64(22), 8249-8255, 2004

がん幹細胞とそれを支持する血管ニッチ高倉伸幸　（たかくら　のぶゆき）大阪大学微生物病研究所情報伝達分野　教授
組織形成の理解において、幹細胞の自己複製や維持を支持する生態学的適所、いわゆるニッチの解析が非常に重要であることから、種々の臓器や器官において、組織特有の幹細胞の局在に関して解析が進められてきている。なかでもその表現型が比較的明らかにされている造血系および神経系において、造血幹細胞や神経幹細胞が血管近傍で自己複製することが解明され、いわゆる「血管ニッチ」の概念が提唱されてきた。　この血管ニッチの存在は正常組織だけでなく、がん組織でも同様である可能性が示唆されてきた。脳腫瘍のがん幹細胞も血管領域をニッチとしているという報告がなされた。しかし、ただ単に局在していることを解明しただけでは、その領域が本当にがん細胞産生の中心領域であり、がん幹細胞の自己複製が営まれている領域かどうかは判断できない。我々は幹細胞に備わる自己複製能に着目し、自己複製活性の高い胎児期の正常造血幹細胞のcDNAライブラリーから、休眠中の幹細胞に発現しない遺伝子の網羅的な抽出を行った。単離された遺伝子のなかでは、PSF1という、酵母ではDNA複製因子として機能する分子の発現が増殖中の幹細胞に特異的に高発現することが判明した。ほ乳類におけるPSF1の機能は詳細ではないが、ノックアウトマウスの解析結果、いわゆる全能性幹細胞である内部細胞塊の増殖に必須であることが判明した。また、PSF1のヘテロ欠損マウスを用いた解析から、PSF1のアリルが一方でもないと、抗がん剤による骨髄抑制後の骨髄回復期における急速な造血幹細胞の増殖に障害が生じることが判明した。つまり、PSF1は、少なくともほ乳類においては未熟な幹細胞レベルでの細胞増殖に必須であることが判明した。そこで、PSF1はがん幹細胞の自己複製マーカーとして有用ではないかと考え、PSF1の発現を中心にがん幹細胞の性質を解析した。　PSF1のヒト固形癌組織における発現細胞の局在は極めて特徴的である。我々の解析した限り、肺がんや食道がんにおいて、PSF1発現細胞は、腫瘍周囲のCD34に染色される血管近傍で群れをなしていた。よく観察すると、PSF1が内皮細胞と直接接着するのではなく、間葉系細胞の周りに存在していると考えられた。このような腫瘍周囲の血管の近傍に存在している、PSF1を強く発現するがん細胞ががん幹細胞に値するものかどうか、ヒトの腫瘍サンプルを用いた実験は困難である。表面抗原に対しては抗体を用いてセルソーターで生細胞を回収できるが、PSF1は細胞内蛋白であり、抗体を用いた生細胞の回収が困難である。そこで、我々はマウス腫瘍細胞にPSF1遺伝子のプロモーター制御下にGFP蛍光蛋白を発現させることで、PSF１遺伝子発現活性の高低を可視化してがん幹細胞の可視化を試みた。　近年提唱されてきているがん幹細胞を同定する判断基準は、１）同じ表現型を有するがん細胞で、マウスから次のマウスへ連続的に腫瘍形成能が持続すること、２）マトリックスを消化して浸潤能が高いこと、３）転移活性が高いこと、４）遺伝子型がES（embryonic stem）細胞に類似すること、そして、５）抗がん剤などの治療に抵抗性を示すこと、である。我々はPSF１プロモーター制御下にGFPを発現する腫瘍細胞をマウスに移植して形成された腫瘍組織からの細胞を用い、PSF1遺伝子プロモーター活性が高い細胞は、上記の条件をすべて満たすことを証明した。上記のように、ヒトではPSF1を高発現するがん細胞が腫瘍の周囲の血管領域に観察された。そこで、マウスの腫瘍モデルでも同様の解析を行ったところ、腫瘍中心領域でも若干のPSF１陽性細胞は観察されるが、腫瘍周囲のやはり血管領域に圧倒的に多くのPSF１陽性細胞が存在することが判明した（図１）。つまり、マウスの解析結果から考察して、がん組織でのがん幹細胞の局在は、固形癌の場合腫瘍周囲の血管であり、正常組織と同様に幹細胞の血管ニッチの概念が適応できると考えられる。　このような血管領域でどのような分子機序によりがん幹細胞の自己複製や未分化性の維持がなされているのかは現在のところまだ解明されていない（図２）。造血幹細胞の自己複製の研究が、幹細胞を支持するストロマ細胞が開発されて発展してきたことから、それをレッスンとして、がん幹細胞の幹細胞性を支持するストロマ細胞株の確立が必要であると考えられる。

腫瘍の低酸素環境応答とその可視化

近藤科江　（こんどう　しなえ）

東京工業大学大学院生命理工学研究科生体機能制御工学分野　教授

　腫瘍は低酸素性疾患である。腫瘍血管の構造的欠陥や不均一な分布により形成される慢性および急性の低酸素領域は、腫瘍特有のものである。また、１ミリ以下の微小ながんにも低酸素領域が存在するため、がんを感度良く診断し、確実に治療するための有用な標的となり得る(Kizaka-Kondoh S, et al. Adv Drug Deliv Rev. 2009) 。さらに、最近の分子生物学的解析により、がんの低酸素領域で特異的に活性化する低酸素誘導転写因子HIFの機能が、血管新生の亢進、アポトーシスの回避、がん細胞の増殖亢進、薬剤耐性、転移・浸潤に関与する遺伝子の発現を誘導し、がんの治療不良や悪性化に深く関わっている事が明らかになってきた(Semenza, G.L. Nat Rev Cancer, 2003)。更に、細胞の未分化状態の維持にHIF活性が関与している事も明らかにされ、がん幹細胞様細胞と低酸素の関連にも注目が集まっている (Mohyeldin A. et al., Cell Stem Cell, 2010)。がん微小環境でのHIFの活性化は、がん細胞に限らず、共存している間質系・内皮系・血球系の細胞でも起こり、がんの悪性化に貢献している。従って、がん細胞のみでなく、腫瘍内でがん細胞の増殖・悪性化を支える細胞群も同時に標的にすることががん治療にとって重要である。
　我々は、腫瘍内でHIFが活性化される低酸素細胞群を標的とした微小環境標的薬の開発研究を行っている。まず、HIFが活性化される低酸素環境を可視化する目的で、HIFの転写活性依存的にルシフェラーゼを発現するレポーター遺伝子を安定に組み込んだがん細胞を構築した。そのがん細胞をマウスに移植して腫瘍を形成した後、ルシフェラーゼとその基質であるルシフェリンとの反応で生じる化学発光を非侵襲的に観察する事で、同一マウスの固形腫瘍内HIF活性を経時的にモニタリングする生体光イメージングシステムを構築した。HIFの酸素依存性は、αサブユニット（HIFα）タンパク質の安定性が、酸素依存的分解ドメイン(ODD)を介して酸素依存的なプロリン水酸化酵素(PDHs)により制御されている事による。我々は、HIFαの酸素依存的制御と同様の制御を受けるPTD-ODD融合タンパク質を構築し、HIF活性を有する低酸素がん細胞特異的に細胞死を誘導する抗がんタンパク質製剤POP33を開発した。すい臓がん同所移植モデルにPOP33を投与すると、固形腫瘍内HIF活性は有意に低下し、転移・浸潤が抑制された（図１）。その結果、有意な延命効果をもたらす事が分かった(Kizaka-Kondoh S. et al., Clin Cancer Res. 2009)。更に、PTD-ODD融合タンパク質の体内動態を観察するために、近赤外蛍光色素で標識したPTD-ODDプローブを担がんマウスに投与して、経時的に蛍光シグナル分布を観察したところ、PTD-ODD融合タンパク質は、投与後の早い時期に腫瘍に集積し、24時間から48時間腫瘍に留まっていることが分かった（図２）。PTD-ODDプローブの蛍光シグナルと上記ルシフェラーゼレポーターシステムによるHIF活性を有するがん細胞からの発光シグナルを比較したところ、強い相関があることが分かった(Kuchimaru T. et al., PLoS One. 2010)。これらの結果は、PTD-ODD抗がんタンパク質がHIF活性を有する低酸素細胞群のターゲティングに有効であることを示すとともに、このイメージングシステムが、低酸素領域を比較的多く持つとされている悪性腫瘍の治療薬や治療法の検証・開発に有用であることを示している。更に有効な抗がん剤を開発するためには、HIFと協働してがんの悪性化に寄与しているがん微小環境シグナル因子(例えばNF-κBやTGF-β)とHIFのクロストークを調べ、より標的特異性の高い薬剤を開発する必要がある。現在、レポーターシステムや３D光イメージングシステムとμCTとの融合画像解析を用いて、新たなin vivo評価システムを構築している。これらの解析から得られた知見を統合して、がんの微小環境を解析し、新たな抗がん剤の開発につなげたい。

図１　HIF活性を有するがん細胞の可視化と環境標的薬剤POP33の抗がん効果

図２　近赤外蛍光色素標識によるHIF活性を有する細胞特異的融合タンパク質の可視化

腫瘍微小循環の機能的破綻

宮園浩平　（みやぞの　こうへい）

東京大学大学院医学系研究科分子病理学分野　教授

　がんの微小環境は間質の線維芽細胞をはじめ、炎症細胞、免疫担当細胞、血管、リンパ管に加えて結合組織が存在して特徴的な微小環境を構築している。「がんには個性がある」と言われるように、がんをとりまく微小環境もがんの種類によって多様である。がんの増殖・浸潤・転移のしやすさは、がん細胞自体のもつ特性によってのみで決定されるのではなく、がん細胞と微小環境との相互関係が深く関わっている。
　TGF-βはがん細胞の増殖を強力に抑制するだけでなく、がん微小環境に作用して、上皮?間葉転換（epithelial-mesenchymal transition, EMT）の促進、炎症の制御、血管・リンパ管新生の制御、骨などの遠隔組織への転移などに重要な働きを持つ。多くのがんはTGF-βによる増殖抑制作用を受けなくなっており、一方で腫瘍組織はTGF-βを豊富に産生している場合が多い。この結果、腫瘍組織で作られたTGF-βはがんの微小環境に作用し、しばしばがんの進行を促進する働きを示すことが知られている。
　EMTとは上皮細胞が上皮としての形質を失い、間葉系細胞の形質を獲得する現象である。EMTでは細胞間接着が失われ、細胞の運動・浸潤能が亢進する。間葉系細胞に分化した細胞は組織の線維化を促進し、またがん細胞への形質転換にも寄与する。TGF-βは様々な上皮細胞に作用してEMTを誘導し、E-cadherinなどの上皮マーカーの発現の抑制、N-cadherinやSmooth muscle a-actin、 aSMA)などの間葉マーカーの発現亢進に関与する。我々はマウス乳腺上皮細胞NMuMGを乳がん細胞4T1と共培養すると、NMuMG細胞がaSMAを発現しない、より活性化された線維芽細胞様細胞(activated fibroblast)に分化することを見出した。4T1細胞はTGF-βのほかにFGF2を産生しており、活性化線維芽細胞様細胞はTGF-βとFGF2を投与することによっても得られることを確認した。EMTを起こした細胞ではmRNAのスプライシングを制御するタンパク質ESRPの発現が低下する結果、FGF受容体のスプライシングパターンが変化することによりFGF2の作用を受けやすくなっていることも明らかとなった。さらに活性化線維芽細胞様細胞は高い運動能を持ち、ヒト乳がん細胞に作用してがん細胞の浸潤を亢進させた。以上から、がん細胞が作るTGF-βとFGF2は周囲の上皮細胞のEMTを促進し、EMTによってできた活性化線維芽細胞様細胞は、がん細胞に作用してその浸潤能を促進させるという、相互のinteractionがあることが明らかとなった。
　スキルス胃がんでは強い線維化が見られ、特殊な腫瘍微小環境を形成しているが、これは腫瘍細胞や周囲の間葉系細胞がTGF-βを大量に産生するためと考えられている。我々はスキルス胃がんの細胞株を用いてTGF-βの作用を検討した。その結果、TGF-βのシグナルを遮断するとトロンボスポンジン1 やTIMP2 の産生低下により血管新生が促進され、腫瘍の増殖が促進されることを示した。トロンボスポンジン１の遺伝子を導入するとTGF-βのシグナルを遮断しても腫瘍の増殖が抑えられることを確認した。またスキルス胃がんからがん幹細胞を単離したところ、TGF-βシグナルを抑制することによりがん幹細胞様細胞が増加し腫瘍形成能が亢進することが明らかとなった。このようにスキルス胃がんでは周囲の微小環境の作用によってin vivoでの増殖が制御されていることが明らかとなった。
　がんにおけるTGF-βの作用は複雑で、TGF-βの二方向性の作用はがん幹細胞やがん微小環境に対しても観察される。がんの進展におけるTGF-βシグナルの作用を明らかにすることで、今後の診断・治療への応用を可能にすることを期待したい。

がん細胞の環境応答ー臨床的立場から矢野聖二　（やの　せいじ）金沢大学がん進展制御研究所腫瘍内科　教授
がんの治療は分子標的治療薬の導入によりパラダイムシフトが起こりつつある。例えばEGFR活性型遺伝子変異やEML4-ALK融合遺伝子のある肺がんにおいては、それぞれEGFRチロシンキナーゼ阻害薬(TKI)やALK-TKIが著効を示す。しかしながら、これら分子標的薬が一旦著効した症例も数年以内にほぼ例外なく再発する（図1）。これはがん細胞が薬剤に耐性を獲得するためで、この獲得耐性が臨床的に克服すべき次なる課題になっている。　EGFR-TKIやALK耐性の分子機構としては、標的遺伝子に生じるゲートキーパー変異(EGFRのT790M、ALKのC1196M)や遺伝子増幅、バイパス生存シグナルを生じる受容体遺伝子増幅など、がん細胞に生じる遺伝子変異に関する研究が主になされてきた。一方、がん細胞は微小環境を構成する様々な正常細胞に囲まれており、その環境応答により増殖や浸潤能のみならず分子標的薬感受性も制御を受けることが容易に推測される。　私たちは微小環境を構成する線維芽細胞から産生されうる肝細胞増殖因子(HGF)に着目し、HGFがEGFR変異肺がん細胞においてゲフィチニブの耐性を誘導することを明らかにした(Yano S et al, Cancer Res, 2008)。HGFはMetをリン酸化し下流のPI3K/Akt経路を活性化することでバイパス生存シグナルを惹起しゲフィチニブ耐性を誘導していた（図2A）。また、線維芽細胞のなかにはHGFを高発現するものがあり、HGFを高発現する線維芽細胞はEGFR変異肺がん細胞のEGFR-TKI耐性をin vitroのみならずin vivoにおいても誘導した(Wang W, et al, Clin Cancer Res, 2009)。　さらに、日本人症例におけるHGFによる耐性の頻度を明らかにするために、国内12施設で共同研究を行った。EGFR-TKIに獲得耐性となったEGFR変異肺がん23サンプルを解析した結果、EGFR-T790M二次的遺伝子変異は52％、Met遺伝子増幅は9％、そしてHGF過剰発現は61％にみられた(Yano S, et al, J Thorac Oncol, 2011)ことから、少なくとも日本人においてはHGFが最も頻度の高い獲得耐性因子であることが示唆された（図3）。一方、自然耐性腫瘍においてはEGFR-T790M二次的遺伝子変異やMet遺伝子増幅はほとんど検出されなかったのに対し、HGF過剰発現は29％にみられた。興味深いことに、一部の症例ではがん細胞ではなく間質の細胞（おそらく線維芽細胞）がHGFを過剰発現していたことから、HGFはがん細胞のみならず微小環境からも産生され、EGFR-TKIの獲得耐性のみならず自然耐性をも誘導する耐性因子であることが明らかとなった。　また、EML4-ALK肺がんにおいては、EGFRリガンドであるEGF, TGF-a, HB-EGFなどがEGFRをリン酸化し、下流のPI3K/Akt経路を活性化することでバイパス生存シグナルを惹起し、ALK阻害薬であるクリゾチニブに対して耐性を誘導することを見出した（図2B）。EGFRリガンドはおもに血管内皮細胞から産生され、血管内皮細胞と共培養することでEML4-ALK肺がん細胞のクリゾチニブ耐性が誘導され、この耐性は抗EGFR抗体やEGFR-TKIにより解除された。　以上のように、がん細胞は線維芽細胞や血管内皮細胞と環境応答することで分子標的薬に耐性化することが明らかとなった。したがって、がん細胞の環境応答を制御する新たな治療戦略により分子標的薬の治療成績の向上が期待される。

図１　分子標的治療における獲得耐性 EGFR変異陽性の肺がん症例。ゲフィチニブによる治療に著効を示したが、治療を継続したにも関わらず1年2月後に耐性となった。

図2　微小環境が産生するリガンドによるバイパス生存シグナル線維芽細胞が産生するHGFや血管内皮が産生するEGFRリガンドがバイパス生存シグナルを惹起し、EGFR-TKIやALK-TKIの耐性を誘導する。

図3　日本人EGFR変異肺がん症例におけるEGFR-TKI獲得耐性因子の発現

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